От биореактора до криобанка: как сохранить жизнеспособность клеток после наработки

Bioengine — это наш ключевой партнёр по средам. Компания работает с 2014 года и имеет все соответствующие сертификаты. У них в среды выпускается формата 10 л в сухом виде. И они выпускаются именно для определённых уже клеточных линий.

Например, как следы для получения вакцин, тут есть и среды для клеточной и генной терапии, а также среды для наработки антител. Мы даём пробники на них. То есть, если вам заинтересовали эти среды, вы можете написать мне. У меня будут в конце презентации будут контакты. И, соответственно, мы можем дать вам попробовать эти среды.

Второй компонент — это вода. Вода — основа, как бы среды. Мы предлагаем полную линейку. Это, во-первых, такие системы на замену классических дистилляторов на основе фильтров. И также поставляемые системы получения воды второго и третьего и первого типа. Ну и, соответственно, пластико и стекло для культивирования, в чём будут расти клетки.

Есть и для адгизионных культур. Мы работаем c Jet Biofil и Nest, особенно по роллерным бутылям с Jet Biofil. Мы для суспендионного культивирования работаем с Nest.

Они предлагают различные бутыли: колберленмеры с отбойниками и без, с вентилируемыми крышками и без. Также мы поставляем различные вот такие крышечки, бутыли, и вот на замену, например, целлюлозных крышек ватных пришли вот такие вот плёночки.

Дышащие плёночки. И также помимо пластика, у нас есть и стекло, это глазка. У них тоже есть различные виды корлимера, матрасы стеклянные, пробирки и так далее. Само культивирование как бы происходит в определённом оборудовании.

Из линейки оборудования мы, во-первых, предлагаем шейкеры-инкубаторы производителя Labwit австралийской компании австралийского бренда. Они предлагают настольные варианты: горизонтальные, двухуровневые платформы, штабелируемые, штабелируемые есть как и бактериальные.

Культивирование, такое культивирование растений и клеток эукариоз с удвое влажностью. Уникальной фишкой шейкеров-инкубаторов является плавная регулировка амплитуды до 50 мм, что была такой единственная фишка только у кюнеров раньше.

Мы их даём на демо, то есть мы с ними работаем уже больше трёх лет, поэтому будем также выставлять большой шейкер-инкубатор на мультиконференции у нас, то есть приходите, можно посмотреть. И на Эфе маленькие.

Как альтернатива большому шейкеру-инкубатору мы предлагаем шейкер СО2 — инкубатор, который выдерживает до 20% концентрацию СО2 и при этом не окисляется, и электроника у него не летит.

Сами целых два инкубатора. И если есть большие, нужно накультивировать в большом количестве культуры, то есть вот такой вариант двухуровневых платформ и шестиуровневых платформ. Ну и, конечно, мы предлагаем сами биореакторы и даём надемы лабораторные модели. Их предлагаем именно вот, которые классические с мешалкой на ДМ.

Также у нас есть различные биореакторы: и волновые с одноразовыми мешками, вертикальные с мешками до 2 000 л и остальные стерилизуемые паром. Вот вертикальные с мешками мы в прошлом году на Фармтехе выставляли для демонстрации.

Из новинок таких интересных для R&D, может быть интересны биореакторы для параллельного культивирования. То есть здесь такие маленькие биореакторы, как и для бактериального и культивирования Эокариот.

В маленьком формате для того, чтобы можно было быстро проверить эффективность различных штаммов и клеток. И также для разработки, оптимизации сред, выбора сред, процесса культивирования. Они есть как со стеклянными сосудами, многоразовые, так и с одноразовыми сосудами. И вплоть до таких маленьких биореакторов можно поставить до 96 штук параллельно по восемь групп. То есть здесь вот эти одноразовые сосуды, они одноразовые.

Как и сам биореактор, мы предлагаем, он не может работать как бы без обвязки, без сопутствующего оборудования, поэтому мы предлагаем и чиллеры к нему подбираем, и воздушные компрессоры, и кислородные концентраторы.

Есть у нас также автоклавы для стерилизации биореакторов, причём с подъёмным механизмом, который как бы. Загрузом есть корзина, в него загружается биореактор, и как бы этот подъёмный механизм поднимет вам биореактор и опустит в автоклав.

То есть не нужно будет всё это вручную поднимать и надрывать спину. Также у нас есть и мелочи для биореакторов. Это и колбы для подпиток от компании Глазка Индия, крышечки для подпиток различного вида с различными портами, одноразовые порты и шланги. Как и термопластичные, так и классические, обычные. Соответственно, при работе с биореактором важно сохранить стерильность.

Здесь незаменимые будут системы для работы для спаивания и запаивания трубок. У нас есть спайщик шлангов от компании Applitech, причём у него лезвия подходят к системе спайки сарториус. Мы проверяли несколько раз, то есть убедились в этом. Также есть запайщики шлангов, как и формата такого большого, который можно повесить на нержавеющую биореактор из нержавеющей стали, так и небольшого формата ручного.

Работает автоматически. И если у вас, например, шланги, которые не термопластичные, то есть вот такие обрезатели шлангов на которые одеваются кольца, и затем этот абиокатор его перерезает и зажимает этими пластинами. И получается у вас стерильный разрез шлангов, которые не термопластичные.

Так, культура растёт, да, но нам обязательно нужно проконтролировать, всё ли в порядке с нашей клеточками, то есть живы они там, истощилась ли питательная среда или, наоборот, не накопились ли метаболиты, которые будут токсичны на неё влиять. Из решений мы предлагаем вот такие анализаторы метаболитов и состава состава среды, в которых можно смотреть все параметры питательной среды: и глюкозу, и перуват, и ионы, мочевину, также контролировать накопление метаболитов.

Классический — это лактат, аммиак, также можно смотреть уксусную кислоту. И даже есть продукты некоторые, например, человеческий гиджей или мышиный. Из такого компактного формата есть анализатор только глюкозы, например, для анализа истощения глюкозы в среде.

И для биореакторов классикой является датчики Гамильтон которые могут мерить общую плотность клеток, жизнеспособность клеток сразу же в биореакторе, глюкозу, растворённый кислород. При этом они автоклавируемые. Как альтернатива, хмм, можно использовать для рутинного контроля микроскопы.

Как альтернатива, можно использовать для рутинного контроля микроскопы.

То есть у нас есть прямые микроскопы Magus, инвертированные микроскопы и также вот такая вот система онлайн-мониторинга для аггезивного культивирования в CO2-инкубаторы. То есть альтернатива инвертивному микроскопу, при этом вся информация будет выводиться на компьютер. Самый важный параметр, пожалуй, является это количество количество живых клеток и жизнеспособность клеток.

И как сказать, альтернативы датчику в биореакторе в жизнеспособности мы предлагаем такие вот счётчики клеток, которые можно посмотреть при отборе проб, например, из биореактора или. Шейкер инкубатора. У нас есть счётчики клеток RVD довольно-таки рабочая лошадка, из особенностей слайды от RVD подходят каунтус термо, то есть мы проверяли, если у вас, например, стоит каунтус второй, то можно использовать недорогие качественные слайды от RVD.

Также как, если, например, у вас требуется IQ и валидация, у нас есть как альтернативные счётчики клеток Applitech. При этом они отличаются от счётчиков РВД тем, что у них есть свой, как бы, слайд и флюоресценция по пропидиадиду акрединовому, оранжевому в специальной технологии.

Ну и если вам нужен более подробный анализ, то можно всегда использовать проточную цитометрию с окрашиванием пропидии и адида и смотреть, в том числе, и клеточный цикл. Для отслеживания апоптоза и количества мёртвых клеток. Итак, вот мы перешли к самому главному, одному из ответственному.

Во-первых, нужна особая посуда. Это Криопробирки, которые выдерживают и -80° и пригодны к хранению в азоте.

У нас есть пробирки различного объёма, как от одного до 10 мл. Обязательно выбираются крышечки от ваших потребностей, там с внешней или внутренней резьбой: конические, круглодонные, устойчивые или без юбки. Один из вариантов, вот новинка у нас — это криогены вялые из циклофинилового полимера для хранения образцов именно в азоте. Они прозрачные, химически инертные, идеальны для клеточной терапии.

И если у вас, например, клетки в большом объёме нарабатываются, то есть криомешки специальные, вот от одного до пятидесяти литров с такими вот кассетами для замораживания и оттаивания. Эта кассеты нужны для того, чтобы как бы мешки не продавливали друг друга, то есть хранились вот в таких кассетах в целостности и сохранности. И в них можно и замораживать, и оттаивать, размораживать мешки.

Cоответственно, помимо криопробирки вам нужно подготовить в среду. Для замораживания добавить криопротекторы, чтобы у вас клетки не разорвало от кристаллов, образовавшихся при замораживании в. Внутри клетки классикой является ДМСО — протектор для клеток млекопитающих до 10% обычно ему добавляют. Как варианты, есть глицерин, этилингликоль, пропилингликоль.

Делается это всё на сыворотке для приготовления крем-среды. Там тоже подбирается экспериментально процент. В некоторых случаях можно добавить к декстроз, эндекстрант как защитный агент, который понижает немного токсичность ДМСО при разморозке, например. И если вам, например, не хотите готовить сами среды для заморозки, можно уже использовать готовые среды для заморозки сервис BIO. Они есть как с ДМСО, так и без ДМСО

Как не перепутать такое количество пробирок, если вот у нас, например, наработалось большое количество клеток и мы раскапали их? Вот применяется вот маркировка. Конечно, всегда классикой является перманентный маркер, но если у вас очень большое количество пробирок, то можно. Запутаться либо повышается риск доминации.

То есть, как вариант для автоматизации можно применять принтер и бреди с наклейками, которые выдерживают до -196°C, при этом они не разваливаются, не отклеиваются с чёткой нанесением печати. Из новинок появилась вот такая лазерная система для маркировки Service Bio. То есть она наносит гравировку прямо на пробирку, она её невозможно будет стереть.

То есть это вырезается именно на самих пробирках, на различной по сути. И для отслеживания там по наклейкам и по лазерной системе в лазерной системе можно наносить не только буквы, но ещё и QR-коды и штрих-коды. И в дальнейшем можно использовать такие сканеры для креп-пробирок, с как бы для считывания образцов, чтобы они автоматически у вас, например, в базу заносились, и не нужно было это вручную всё писать.

Итак, мы подготовили пробирки, подготовили среду, промаркировали пробирки. Теперь нужно раскапать, соответственно, клеточную суспендию, при этом нужно сделать это асептически. Как вариант, для автоматизации, например, для крио-банков, мы предлагаем вот такую систему розливов крио-пробирки.

Она упрощает как бы работу при большом количестве пробирок, то есть она сама расуть этой системы в том, что она сама вам открутит крышечки с пробирки, зальёт туда клетки и, соответственно, закрутит крышечки.

Здесь используются одноразовые системы для разлива. После её использования она выкидывается с системы стерильные пластиковые трубочки, которые будут заливаться клетки.

Эту систему можно подключить как и через Мама-папа, так и c помощью спальщика-запальщика к вашей культуре клеток. Сама культура ставится на перемешивания на шейкер для того, чтобы не осели клетки и было всё равномерно. После этого заполняются трубки до начала розлива.

Загружаем наши пробирки. Пробирки могут быть любые, то есть у них есть стандартные варианты, какие можно использовать пробирки, но эту систему можно настроить и под ваши варианты пробирок. Как и с внешней, так и с внутренней жизни. То есть в самом ПО оно автоматически будет настроена. Вы выбираете вид пробирок, который вы загрузили. Можно все параметры настроить.

Как и скорость розлива, объём розлива, с какой пробирки начинать, с какими, сколько количество пробирок заполнить, не заполнить, то есть всё это настраивается. Соответственно, это всё довольно быстрый, как сказать, юзер-френдли. Потом вы включаете просто одну кнопку нажимаете, и система сама всё за вас сделает.

Система розлина сама развивается пробивки. Довольно быстро происходит. Опять же потом возвращают назад и закручивает крышечки назад.

Есть ещё система для фасовки в мешки, если вы использовали виалы , вот именно вот такие большие криогенные виалы от компании Цитониша.

У них в этот модуль большой встроенный системы для перемешивания клеточного продукта с контролем температуры. Затем идёт модуль самой фасовки вялым до 10 мл. Ну, не переходим непосредственно к процессу заморозки. Всё у нас мы подготовили, заполнили пробирки, готовили всё к заморозке.

Теперь самое важное — это проконтролировать именно сам процесс заморозки. То есть нельзя просто, как сказать. Пробирки с кривопротектором поставить в морозилку. Как бы там будет очень нестабильная идёт заморозка. И оптимальной вообще скорость заморозки для клеток является 1°C в минуту.

То есть, если быстрее, то произойдёт внутриклеточное образование внутриклеточных кристаллов льда, если медленнее клетки могут погибнуть от осматического шока. Поэтому есть такие специальные системы для заморозки, которые как бы обеспечивают условия постепенного понижения температуры для аккуратной заморозки клеток. Мы будем идти до самого технологичного.

И первое — это самый простой способ заморозки — штатив для замораживания. Он как раз за счёт своей конструкции кольца и материала обеспечивает вот эту равномерную. Скорость заморозки 1°C в минуту и он ставится просто в него загружаются пробирки, и он ставится в морозильник. По инструкции где-то 4 ч, но обычно по классике его оставляют на ночь.

У них в этот модуль большой встроенный системы для перемешивания клеточного продукта с контролем температуры. Затем идёт модуль самой фасовки вялым до 10 мл. Ну, не переходим непосредственно к процессу заморозки. Всё у нас мы подготовили, заполнили пробирки, готовили всё к заморозке.

И потом с утра вытаскивают штатив этот, пробирки загружают уже в азот в сосуд Дьюара , а сам штатив оставляют при комнатной температуре, дабы он. Для следующей заморозки, чтобы он дошёл до комнатной температуры, оттаял для использования при следующей заморозке. Вот так вот выглядит график постепенно. За 4 часа он проведёт замораживание. Более технологичные, ну, то есть, и в принципе замораживание со штативом результаты вполне сравнимы с такими вот программируемыми замораживателями.

Но если вам нужен именно полный контроль и проконтролировать, так сказать, получить протокол заморозки в виде чека, то здесь используются программные замораживатели. Диапазон у них температурный от +50 до -180. Можно использовать, замораживать как пробирки, так и соломинки, трансфузионные мешки. Мы предлагаем системное замораживания от Haier, и в комплекте с ними идёт сосуд Дьюара для как раз-таки подачи азота со шлангом.

И принтер встроен. После завершения программы заморозки, либо после, например, замораживания в штативе, образцы отправляются на долгосрочное хранение.

Здесь у нас есть CryoBio. Мы предлагаем от Haier как оптимальный вариант для лаборатории. Объём у него — это новая автоматическая система криохранилища с автоматической дозаправкой.

Испарение жидкого азота в рабочем режиме у него составляет полтора литра в день. Есть цветной принтер, ой, цветной дисплей для который позволяет работать в перчатках, то есть он это. Всё нормально переносит на экран. Есть протоколирование данных работы прибора, функция удаления тумана жидкого азота при открытой крышке. Ну и в стандартную комплектацию входит как шесть штативов по десять крео-пробирок.

Ну и, соответственно, для автоматической дозаправки сосуда Дьюара можно подключить точнее, креохранилищу можно подключить сосуд Дьюара. Есть более технологичный вариант — это система хранения с автоматической уже дозаправкой. То есть, если там нужно подключать азот.

Cама конструкция крышки исключает образование инея на горловине, у него интегрированная крышка, сенсорный дисплей, бэйпас на линии заполнения жидким азотом. И есть также протоколирование данных.

Также мы предлагаем такие большие системы хранения. Ну, для биотехнологических производств, то есть тут уже объёмы от 350 до 1880 литров, большие системы кареохранилища. Также есть подпитка от азота.

В него встроена система Cryosmart LN2, обеспечивающая управление и контролем сенсорного дисплея, причём на нём можно работать в перчатках. И карусель для крио-штативов. Также можно подключить режим автозаполнения азотом.

Также, если хранение в азотике — это надёжно, но если у вас, например, Образцы хранятся при минус 40°C или просто при временно, нужно клетки сохранить там до проведения эксперимента, то есть и холодильники для образцов с такой новинкой орфит-метками. То есть суть в том, что вам не нужно будет ввести как бы. Для заполнения данных вам можно будет использовать вот такой принтер, который распечатывает RFID-метки. Они приклеиваются на образец.

Затем, когда вы заносите образец в холодильник, холодильник сам автоматически заносит, как бы вот здесь вот на экране. В свою базу образец. То есть показывает, что образец, например, был взят или образец вернули на место и где он находится. Такие морозильники скоро выйдут. А пока сейчас есть холодильники от 2° до +8°C с большим объёмом 639 л УХР.

Путь замыкается на разморозке образца, если для использования в каких-нибудь экспериментах либо наработках и тут важно правильно также разморозить клетки, чтобы они сохранили свою жизнеспособность.

После заморозки можно, конечно, использовать классическую водяную баню с подогревом, но само ручное размораживание в этой водяной бане часто может привести к перегреву клеток у стенок пробирок, пока сердцевина ещё холодная. А в данном решении.

Во-первых, оно позволяет контролировать, протоколировать процесс разморозки.

Во-вторых, вот это вот обеспечивает равномерное оттаивание без перегрева. Эти вот модели. Там холм от Кимиссера. Они рассчитаны на небольшое количество пробирок, то есть максимум четыре криопробирки. Также есть модели для пакетов для одного пакета. В принципе, на этом у меня всё, коллеги. Вот, в общем-то, мы прошли с вами от этапов наработки для культивирования клеток до процесса подготовки заморозки, самой заморозки и размораживания клеток.

То есть важно на каждом этапе как бы проконтролировать жизнеспособность клеток. Обязательно подобрать оборудование правильное и условия заморозки. Ну, то есть криопротекторы, среду для заморозки. Перед этим, конечно же, проверить, что у вас после наработки клеточная линия живая, её посчитать её количество и запротоколировать жизнеспособность.